Nos travaux sur les diglycosidases de la vigne

INTRODUCTION.

Les oligosaccharides et polysaccharides ont une diversité structurale et fonctionnelle exceptionnelle qui est un défi pour les enzymes responsables de leur hydrolyse sélective (glycosidases, polysaccharide lyases), leur réarrangement (transglycosidases), leur biosynthèse (glycosyltransférases) et leur modification (carbohydrate estérases). Parmi ces enzymes, les O-glycosyl-hydrolases sont un groupe répandu d'enzymes qui hydrolysent sélectivement les liaisons glycosidiques. Ces enzymes sont à la base de nombreux processus biologiques (dégradation de polysaccharides de réserve ou de structure, signalisation cellulaire, interaction hôtes-pathogénes, mécanismes de défense, etc.…) ainsi que de nombreuses applications biotechnologiques (Henrissat, 1995).

Dans ce groupe, les b-glucosidases (EC 3.2.1.21, b-D-glucoside glucohydrolases, gentiobiase, cellobiase, amygdalase, limarase) catalysent l'hydrolyse des aryl-, alkyl- ou oligo- b-D-glucosides, libérant un b-D-glucose et un sucre ou un aglycone (Reese, 1977). Ces enzymes sont omniprésentes dans le monde vivant (Woodward et Wieseman, 1982). Dans le règne végétal, les b-glucosidases ont été identifiées dans de nombreuses espèces comme le trèfle (Trifolium repens L.), le maïs (Zea mexicana L.), le manioc (Manihot esculenta L.), la papaye (Carica papaya L.) ou l'amande douce (Amygdalus communis L.). Les substrats naturels des b-glucosidases incluent les différentes molécules conjuguées aux b-glucosides présents dans le métabolisme secondaire végétal (Conn, 1981; Niemeyer, 1988; Leah et al., 1995). La plupart des b-glucosidases possèdent une assez proche spécificité pour la partie glycone de leurs substrats. Cependant, les b-glucosidases isolées à partir des plantes diffèrent sensiblement dans leur spécificité vis à vis de l'aglycone (Hösel et Conn, 1982; Hughes et Dunn, 1982).

Les rôles physiologiques des b-glucosidases sont nombreux et sont liés à la nature et à la fonction des aglycones qu'elles libèrent. En effet, certains aglycones devenus actifs après hydrolyse de leurs glucosides conjugués jouent un rôle important dans divers mécanismes métaboliques :
(1) dans le métabolisme des sucres et de l'amidon,
(2) dans le développement et la croissance des plantes (régulation de la rhizogénèse, contrôle de la germination...) via la libération de la forme active des phytohormones telles que les auxines, gibberellines, cytokinines à partir de leurs formes glucoconjuguées respectives (Feldwisch et al., 1994; Simos et al., 1994; Duroux et al., 1998),
(3) dans la régulation de l'organisation structurale des membranes (Kalinowska et Wojciechowski, 1978; Akiyama et al., 1998),
(4) dans le métabolisme de défense contre les pathogènes et herbivores, via la libération d'un poison respiratoire à partir de l'hydrolyse des b-glucosides des acides cyanogéniques, des acides hydroxamiques, stéroïdiens, d'isoflavonoïdes, de saponines, d'homoterpénes et d'indo-alcaloïdes (Kakes, 1985; Hösel et al.,1987; Poulton, 1988; Poulton, 1993; Selmar, 1993; Hopke et al., 1994; Osbourn, 1996; Geerlings et al., 2000; Sue et al., 2000),
(5) dans le métabolisme secondaire des flavonoïdes, lignines et stilbènes (Hösel et al., 1978; Leinhos et al., 1994; Dharmawardhama et al., 1999),
(6) ou dans le rythme circadien des mouvements des feuilles (Ueda et Yamamura, 2000).... De plus, ces précurseurs inactifs de stockage de toutes ces molécules sont présents sous forme mono-, di- ou oligo-b-glucoconjugués. Pour l'hydrolyse des molécules liées aux di-b-D-glucosides, les végétaux ont mis en place deux types de mécanismes d'action : l'hydrolyse séquentielle ou l'hydrolyse directe. Ainsi, par exemple, l'hydrolyse séquentielle des diglucosides cyanogéniques du prunier (Prunus serotina L.), du lin (Linum usitatissimum L.), de l'hévéa (Hevea brasiliensis L.) ou des fougères (Davallia trichomanoïdes L.) se fait en deux étapes (Figure 1). Le sucre terminal du di-b-glucoside (O-b-D-gentiobioside, O-b-D-neolinustatinoside, O-b-D-vicianoside de [R]-mandelonitrile) est d'abord hydrolysé par une exoglycosidase spécifique (amygdaline hydrolase ou neolinustatinase). L'aglycone est ensuite libéré de sa liaison avec le b-D-glucose restant, par une b-glucosidase (prunasine hydrolase, linustatinase) (Fan et Conn, 1985; Selmar et al., 1987; Li et al., 1992; Poulton, 1993; Grühnert et al., 1994).

BUT DU TRAVAIL.

Les travaux réalisés sur les b-glucosidases ont d'une part caractérisé ces enzymes et défini leurs nombreuses fonctions au sein du monde végétal. D'autre part, ils ont aussi montré le rôle important de ces enzymes dans la libération des composés d'arôme (composés norisoprénoïdiques, phénols odorants et dérivés terpéniques) dans les fruits et chez la vigne. Nos travaux se sont focalisés sur la caractérisation génétique et protéique de l'endoglycosidase de vigne. Nous avons aussi identifié cette enzyme dans d'autres organes de la vigne (baies, feuilles, cultures cellulaires) et dans d'autres sources végétales (menthe, rose, thé…). Ces recherches ont essayé de mieux comprendre les fonctions physiologiques potentielles de cette b-glucosidase spécifique des diglycosides dans le metabolisme secondaire et son intérêt dans le potentiel aromatique des produits dérivés des fruits ou fleurs d'intérêt agroalimentaire ou parfumerie.

Alternativement, certains auteurs (Lizotte et Poulton, 1987; Selmar et al., 1988; Grühnert et al., 1994) ont montré un autre modèle où l'hydrolyse des composés à base disaccharidique aboutit, en une étape, à la libération du disaccharide et de l'aglycone (Figures 1 et 2). Ils ont en effet détecté et purifié une activité b-glycosidase (nommée vicianine hydrolase) à partir des vesces (Vicia angustifolia L.), des fougères cyanogéniques et du lin, qui libère directement le gentiobiose et le vicianose à partir du O-b-D-gentiobioside et du O-b-D-vicianoside de [R]-mandelonitrile. De telles enzymes (disaccharidases ou di-b-D-glycosidases) existent dans certaines espèces et quelques-unes d'entre elles ont déjà été étudiées. En effet, Imaseki (1961), Suzuki (1962), Courtois (1964), Bourbouze (1974, 1975) et Plouvier (1978,1979,1980) ont identifié des enzymes présentant ces mêmes propriétés d'hydrolyse des disaccharides conjugués. Ils les ont nommées respectivement furcatine hydrolase (Viburnum furcatum L.), rhamnodiastase (chez les Rhamnus), vicianosidase (Geum urbanum L., Vicia sativa L.), hétéroglycosidase (Fagopyrum tataricum L.), et primévérosidase. A partir de ces travaux, Yasuda (1993) a purifié la rutinase dans les graines de sarrasin (Fagopyrum tataricum L.). Enfin, Yagi (1990) et Guo (1996), Ogawa (1997), Ijima (1998) ont caractérisé et purifié la primévérosidase respectivement chez la graine de cycas (Cycas revoluta Thrumb.) et la feuille de thé (Camellia sinensis L.).

Dans la vigne, ces deux types de mécanisme d'hydrolyse enzymatique ont été mis en évidence (Figure 2). Aryan et al. (1987), Biron et al. (1988), Di Stefano (1989) et Lecas et al. (1991) ont caractérisé deux b-glucosidases dans la baie de raisin, spécifiques des monoglucosides. Gunata et al. (1997) ont détecté et identifié dans la pellicule de baie de raisin une activité enzymatique de type primévérosidase et rutinase. Ce second mécanisme suscite un intérêt certain dans l'industrie du vin et celle des jus de fruits. Car, il permettrait d'exploiter le potentiel aromatique lié au mono- et di-glucosides de façon directe sans l'utilisation de systèmes multi-enzymatiques. Cette enzyme présente aussi l'avantage pour les applications sur fruits mûrs d'être beaucoup moins inhibée par le glucose que la plupart des b-glucosidases.

PRESENTATION DU SUJET.

Il a été montré au laboratoire, dans un premier temps, que les composés d'arômes variétaux (composés norisoprénoïques, phénols odorants et dérivés terpéniques) se présentent sous deux formes: libres, volatils directement accessibles par l'appareil olfaction du consommateur/dégustateur ou liés, donc non odorants. De plus, une part importante des composés d'arôme dans les fruits et plus particulièrement dans le raisin se trouve sous une forme liée aux sucres (mono ou diglycosides). Ce potentiel d'arôme masqué est peu exploité dans les procédés de transformation des fruits. Il est pourtant susceptible d'être hydrolysé en composés libres, volatils et aromatiques, par voie chimique ou enzymatique. Ainsi, l'utilisation d'enzymes exogènes d'origine végétale ou microbienne pourrait constituer un moyen intéressant pour augmenter l'arôme des produits dérivés de fruits. Enfin, chez la vigne les différents cépages sont classés en aromatiques ou neutres en fonction de leur pourcentage en composés d'arôme liés. Dans un deuxième temps, Günata et al. (1997) ont trouvé la présence dans les pellicules de la baie de raisin d'une endoglycosidase, capable de libérer directement les composés volatils liés aux diglycosides en une seule étape.